细胞介绍

THLE-3细胞系来源于人肝脏左叶的原代正常肝细胞，通过SV40大T抗原（SV40 large T antigen）感染实现永生化。具体过程是将含有SV40 T抗原的Bgl I-Hpa I片段的逆转录病毒载体导入兼嗜性包装细胞株PA317中生产病毒，进而感染正常肝细胞，从而建立THLE-3细胞系。THLE-2 和 THLE-3细胞系源自同一供体的正常肝左叶原代肝细胞，使用相同的逆转录病毒载体（含SV40 T抗原的Bgl I-Hpa I片段），经PA317包装细胞株生产病毒后感染肝细胞从而建立以上细胞系。THLE-3细胞表达正常成人肝上皮细胞的表型特征，如细胞角蛋白18（cytokeratin 18）和白蛋白（albumin），在对数生长期的高传代细胞中也表达细胞角蛋白19（cytokeratin 19）。该细胞系具有接近二倍体的核型，不表达甲胎蛋白（alpha-fetoprotein），在无胸腺裸鼠中不成瘤。THLE-3细胞保留了与化学致瘤物代谢相关的酶，包括细胞色素P450途径（cytochrome P450 pathways）、环氧化物水解酶（epoxide hydrolase）、NADPH细胞色素P450还原酶（NADPH cytochrome P450 reductase）、超氧化物歧化酶（superoxide dismutase）、过氧化氢酶（catalase）、谷胱甘肽S-转移酶（glutathione S-transferases）和谷胱甘肽过氧化物酶（glutathione peroxidase）等，能够将苯并[a]芘（benzo[a]pyrene）、N-亚硝基二甲胺（N-nitrosodimethylamine）和黄曲霉毒素B1（aflatoxin B1）等化学致癌物代谢为最终致癌代谢物，这些代谢物可与DNA结合，因此THLE-3细胞是研究药物毒理学和人肝细胞癌病原学及病理的体外模型。

细胞特性

1） 来源：肝; 左叶 用SV40大T抗原进行上皮永生化

2） 形态：上皮细胞样，贴壁生长

3） 含量：>1x10^6  细胞数

4） 规格：T25瓶或者1mL冻存管包装

5)  用途：仅供科研使用。

运输和保存

干冰运输及复苏好存活细胞

（1）1mL冻存管包装干冰运输，收到后-80度冰箱保存过夜后转入液氮或直接复苏，若发现干冰已挥发干净、冻存管瓶盖脱落、破损及细胞有污染，请立即与我们联系。

（2）T25瓶复苏的存活细胞常温发货，收到后按照细胞接收后的处理方法操作。

细胞接收后的处理

1）收到细胞后，75%酒精消毒瓶壁将T25瓶置于37℃培养箱放置约2-3h，若发现培养瓶破损、有液溢出及细胞有污染，请拍照后及时联系我们。

2）请在4或5X显微镜下确认细胞状态，同时给刚收到的细胞拍照（10×，20×）各2-3张以及培养瓶外观照片一张留存，作为售后时收到时细胞状态的依据。

3）贴壁细胞：细胞在37℃培养箱中放置2-3h，显微镜下观察细胞的生长和贴壁情况，有些贴壁细胞在快递运送过程中会因振动脱落和脱落后成团的情况。若镜下观察细胞的生长密度若在60%以下，可去除培养瓶中灌液培养基（若有未贴壁的细胞需要离心回收，重悬打入到原培养瓶中）,加入新配制的完全培养基6-8mL，放到细胞培养箱中继续培养。若细胞生长密度达70%-80%以上，可以对细胞进行传代处理。传代过程中，若因运输振动脱落的细胞需要离心回收。

4）备注：运输用的培养基（灌液培养基）不能再用来培养细胞，请换用按照说明书细胞培养条件新配制的完全培养基来培养细胞。  收到细胞后第一次传代建议T25培养瓶1：2传代 。

细胞培养步骤

一．培养基及培养冻存条件准备

1）准备BEGM kit培养基  (Lonza/Clonetics，CC-3170)备注：培养基包含（A+B），ATCC 不使用 BEGM 试剂盒提供的 GA（庆大霉素-两性霉素 B 混合物）,另向其中添加额外的 5 ng/mL  EGF、70 ng/mL 磷酸乙醇胺和 10% FBS。可根据实验要求添加P/S双抗，1%。

A： BEBM 基础培养基  （货号CC-3171）       500ML

B:  细胞生长添加剂    （货号CC-4175）        一套（包含下列试剂）

● BPE, 2.0 ml ● Hydrocortisone, 0.5 ml    ● hEGF, 0.5 ml

● Epinephrine, 0.5ml  ● Insulin,0.5 ml      ● Transferrin, 0.5 ml

● Triiodothyronine, 0.5 ml ● Retinoic Acid, 0.5 ml ● GA, 0.5ml

ATCC上THLE-3细胞推荐上面的培养条件和试剂来培养该细胞，因市场长期断货，本公司用其它培养体系进行培养传代验证后已经稳定下来配方，该细胞培养体系较为特殊且较难培养，建议直接选择订购经我库官网经优化和测试后可保持THLE-3细胞最佳生长状态的THLE-3细胞的专用完全培养基，用于THLE-3细胞更换培养体系前过渡与保种。

产品主要成分如下

基础培养基                                                 500mL

对应的细胞培养添加剂                             5mL

ITS(胰岛素-转铁蛋白-硒添加剂)              5mL

FSB                                                              50mL

P/S青霉素-链霉素                                      5mL

2）培养条件： 气相：空气，95%；二氧化碳，5%。 温度：37摄氏度，培养箱湿度为70%-80%。

3）冻存液配方：培养液（DMEM培养基+10%胎牛血清 ）92%，DMSO 8%

二．细胞处理

注意： 该细胞较难培养，在培养前建议对细胞培养瓶（皿）进行预包被用混合的0.01 mg/mL纤维连接蛋白、0.03 mg/mL牛胶原I型和0.01 mg/mL牛血清白蛋白。或使用Corning的cellbind细胞培养瓶,货号是3289来进行培养细胞。

1）冻存细胞的复苏

将含有1mL细胞悬液的冻存管在37℃水浴中迅速摇晃解冻，加入到含4-6mL完全培养基的离心管中混合均匀。在1000RPM条件下离心3-5min，弃去上清液，完全培养基重悬细胞。然后将细胞悬液加入含6-8ml完全培养基的培养瓶（或皿）中37℃培养过夜。第二天显微镜下观察细胞生长情况和细胞密度。

2） 细胞传代：如果细胞密度达80%-90%，即可进行传代培养。使用的瓶皿应 预涂 有0.01 mg/ml的纤维连接蛋白、0.03 mg/ml的牛胶原I型和0.01 mg/ml的牛血清白蛋白的混合物，溶解在BEBM培养基中。或使用Corning的cellbind细胞培养瓶,货号是3289来进行培养细胞。

对于贴壁细胞传代可以参考以下方法

1. 弃去培养上清，用不含钙、镁离子的PBS润洗细胞1-2次。

2. 加入0.25％（w / v）胰蛋白酶-0.53 mM EDTA于培养瓶中（T25瓶1-2mL，T75瓶2-3mL），置于37℃培养箱中消化1-2分钟（难消化的细胞可以适当延长消化时间），然后在显微镜下观察细胞消化情况，若细胞大部分变圆并脱落，迅速拿回操作台，轻敲几下培养瓶后加入3-4ml含10%FBS的培养基来终止消化。 

3. 轻轻打匀后吸出，在1000RPM条件下离心3-5min，弃去上清液，补加1-2mL培养液后吹匀。将细胞悬液按1：2的比例分到新T25瓶中，添加6-8ml按照说明书要求配置的新的完全培养基以保持细胞的生长活力，后续传代根据实际情况按1:2~1:5的比例进行。

3）细胞冻存: 收到细胞后建议在培养前3代时冻存一批细胞种子以备后续实验使用。

下面T25瓶为例

1. 细胞冻存时按照细胞传代的过程收集消化好的细胞到离心管中，可使用血球计数板计数，来决定细胞的冻存密度。一般细胞的推荐冻存密度为1×10^6~1×10^7个活细胞/ml.

2. 1000rpm离心3-5min，去掉上清。用配制好的细胞冻存液重悬细胞 ，按每1ml冻存液含1×10^6~1×10^7个活细胞/ml分配到一个冻存管中将细胞分配到冻存管中，标注好名称、代数、日期等信息。

3. 将要冻存的细胞置于程序降温盒中，-80度冰箱中过夜，之后转入液氮容器中储存。同时记录好冻存管在液氮容器中的位置以便后续查阅和使用。